苏格兰女王玛丽·斯图亚特从一五五八年起，便认定自己是英国王位的合法继承人；事实上她最主要的目的，就是接下英国王位能带来的利益，因此她始终拒绝核准《爱丁堡条约》，这份条约完全断绝她在伊丽莎白女王之后，“英国王权第二顺位”的可能性。她也拒绝承认伊丽莎白为英国女王，甚至将英国军徽用在她的部队上。因为这些因素，一五六一年的夏天，伊丽莎白女王拒绝在玛丽·斯图亚特过境英国返回苏格兰时，给予安全通行权。女王后来随即改变心意，但到了八月十九日，玛丽·斯图亚特已经从法国搭船出发抵达爱丁堡的利思港。玛丽·斯图亚特回到暌违二十多年的王国，在许多方面都让伊丽莎白女王烦躁不已。除了因为她的表亲在欧洲天主教派的眼中是比伊丽莎白女王更适合的女王人选，而对伊丽莎白的王朝带来实质的威胁外，国境之北还有宗教冲突的阴影潜伏着：玛丽·斯图亚特告诉罗马教皇，她想要在苏格兰王国内重建天主教信仰。
对个人而言，伊丽莎白女王将玛丽·斯图亚特视为对手：她比伊丽莎白女王年轻，据说也较为貌美；而玛丽·斯图亚特的寡妇身份，代表英国女王不再是欧洲贵族追求的唯一对象。欧洲各国都认定玛丽·斯图亚特一定会再婚，因此她的择偶对表姑伊丽莎白女王来说，也是一大担忧，她担心欧洲的天主教强权进驻邻国。最重要的是，一个觊觎英国王位的天主教徒，距离如此近，让伊丽莎白女王感到芒刺在背。这些事情，加上两位女性执政者之间的角力，在接下来的四分之一个世纪内，一直都是英格兰与苏格兰之间关系的焦点。
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出生于一五四二年，玛丽·斯图亚特在出生一周内就继承了父亲詹姆士五世遗留下的王位，为了逃避亨利八世“强行逼迫”她成为儿媳妇，也就是成为后来的爱德华六世的妻子，年仅五岁的她就被送往法国，和亨利二世的孩子一起接受教育，也因此与王储弗朗西斯（Dauphin Francis）订了婚。童年的时光，她都在豪奢稳定的环境中成长，和表姑伊丽莎白公主的成长过程大相径庭。
玛丽·斯图亚特受的教育，在许多方面都走传统路线。她深受礼赞天主教信仰的影响，并且接受一名身家良好的女性应该要有的才艺教育与可取的知识。和伊丽莎白女王不同的是，她并不爱炫耀学识，反而喜欢弗朗索瓦·拉伯雷（Rabelais）的讽刺文学，或法国文艺复兴诗人皮耶·龙萨（Ronsard）那温文儒雅的诗句，以及拉丁与希腊沉重的文学作品。她从小就学会用法文说写，如母语般流利，但她对意大利文、西班牙文和拉丁文只有一知半解的程度，虽然听得懂，但却无法书写。当她返回苏格兰时，她只记得简单的苏格兰文，只能与尼可拉斯·瑟洛摩顿爵士及约翰·诺克斯礼貌性地寒暄，但她仍非常努力地在语言能力上精进。尽管亨利二世想把玛丽·斯图亚特栽培成法国、苏格兰与英国未来的女王，但他一直认为让玛丽·斯图亚特学英文不太恰当，因此一直到她成年后才开始正式接触英文。
返回苏格兰国境中的苏格兰女王玛丽·斯图亚特，从各方面看来都是美丽优雅的法国女子，会吟诵时髦的十四行诗，也懂得精美的针线活与刺绣，而她的部分作品甚至流传至今，她的字体也非常好看。她总是精心打扮，喜欢音乐、跳舞、芭蕾舞与舞会，同时精通马术。
因为在法国宫廷成长的经验，她相当世故精明。她对男人很有吸引力，这一点毋庸置疑，就连个性阴郁乖张的约翰·诺克斯都形容她“迷倒众生，令人销魂”。尽管玛丽·斯图亚特的名声很好，但她那天生的浪漫与冲动，使她无论多么纯洁，总是勾引着男性，也因为她对人性的判断力不佳，后来都导致许多严重苦果：有些人得寸进尺，其他人则带给她深深的伤痛。更重要的是，尽管她非常懂得运用自身魅力，就连最正直的男人也无法抵挡，但提到统治国家时，她却认定另一半只能扮演她配偶的角色。苏格兰驻英大使莱星顿的威廉·梅特兰，便曾告诉托马斯·伦道夫，在玛丽·斯图亚特身上看不到伊丽莎白女王拥有的成熟判断力与政治经验。
在那个人类平均身高都比现在矮小的时代，身高六尺的玛丽·斯图亚特算是相当修长。她的体型纤细，皮肤白皙，拥有栗色的卷发与棕色的眼睛。在她偏东方风味的脸孔上，却有过长的鼻子，这都是父亲的遗传。举止仪态高雅尊贵，她已经决定要成为最亲民的统治者。她对朋友大方忠诚，因此下属们都很欣赏她。
玛丽·斯图亚特是不屈不挠的女性，十分坚持自己的信念，也有捍卫信念的勇气，但在政治这门艺术上，她却缺乏实战经验。她常任由情绪摆布，易受到心情变化的影响，而且也从不隐藏自己的感受。情势发展良好时，她快乐得雀跃不已，但挫折与压力却容易让她陷入忧郁的悲伤中，一名英国大使不得不以“病态疯狂的女人”字眼来形容她。他人不客气的态度就能让她濒临崩溃边缘，她甚至还有多次因紧张压力而多日卧病在床的记录——这对许多当代人来说，都是非常怪异的行为。与伊丽莎白女王不同的是，玛丽·斯图亚特并不喜欢健康的体能活动，因此常常生病，而她的病因常是体侧不明疼痛。但这些疾病可能都是情绪歇斯底里造成的结果。
对玛丽来说，经历了在法国宫廷中精致豪奢的生活，苏格兰王国为她带来不少文化冲击。苏格兰位处欧洲偏远地区，与文艺复兴带来的文明影响完全沾不上边。苏格兰气候冷冽，住在原始城堡与塔形城堡的贵族们皆未经开化、充满暴力倾向。这里的宗教充满加尔文主义，尽管臣子们热烈欢迎她返国，但不久，她便因公开在礼拜堂中聆听的弥撒仪式中充满“偶像崇拜”，而遭到约翰·诺克斯告诫。约翰·诺克斯的训斥让玛丽·斯图亚特因愤怒而哭泣，但他十分担心新任女王会想要反宗教改革；然而主政派的新教人士早已准备好要容忍她的天主教倾向，毕竟在他们的眼中，伊丽莎白女王与艾伦侯爵未能成婚，无法一统英格兰与苏格兰，让他们仿如受到冷落。说起玛丽·斯图亚特，她其实一点儿也不了解苏格兰人民，也不知道经过与她的母亲玛丽·吉斯对抗后，人民有多么怨恨与法国有关的一切。在多数人眼中，她其实是个外国人。
然而她愿意让步，她很快宣布臣民在礼拜仪式中可享自由。此举安抚了苏格兰国会缙绅们，迅速地，她便在这些政治人物中号召了一批支持者。
在统治苏格兰的前几年，玛丽·斯图亚特的主要顾问，是她同父异母的哥哥詹姆士·斯图亚特（James Stuart），一五六二年她正式册封哥哥为莫雷伯爵（Earl of Moray）。莫雷伯爵是国王詹姆士五世众多的私生子之一，后因进入主圣会并于一五六〇年主导苏格兰宗教改革而崛起。除此之外，莫雷伯爵甚至主动以苏格兰女王之名对抗约翰·诺克斯，并坚持女王可以在自己的小礼拜堂中聆听弥撒，而他也因此得到了玛丽的信任。此后玛丽·斯图亚特一直到再婚前，都以莫雷伯爵的建议来统治苏格兰。
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伊丽莎白女王对玛丽·斯图亚特有着矛盾情结：一方面将玛丽·斯图亚特视为危险的对手，另一方面又因为两人都是女性执政者，还有表亲关系，而认为两人十分相似。因此，伊丽莎白女王宣布，若玛丽·斯图亚特放弃争夺英国王位，伊丽莎白女王就愿意与之交好。虽然塞西尔对此大表反对，但伊丽莎白女王依然坚持要与苏格兰女王一会，她认为两人面对面，就可以一起解决英国王位继承这个令人苦恼的问题，以及《爱丁堡条约》中可能存在的误解。
不久后，玛丽·斯图亚特也有了相同的想法。她有许多怨恨伊丽莎白女王的理由，毕竟伊丽莎白女王在自己的王国中，一手建立了新教霸权，但玛丽·斯图亚特知道，若自己与伊丽莎白女王建立彼此之间的友好关系，绝对有利无害。她始终不愿核准《爱丁堡条约》，主要是因为害怕若放弃英国军徽的使用权，可能会损害自己未来超越伊丽莎白女王的机会。莫雷伯爵与苏格兰领主们，一直希望她能与表姑伊丽莎白女王达成共识：只要玛丽·斯图亚特放弃争夺英格兰王位，伊丽莎白女王便可能将她预立为王位接班人作为回报。当有人将此事呈报伊丽莎白女王时，她一如往常地闪避回答，塞西尔私下则为伊丽莎白女王身后可能再有女性执政者感到万分恐惧。
玛丽·斯图亚特派遣大使威廉·梅特兰到英格兰表达友善的问候，并询问伊丽莎白女王是否有改变《爱丁堡条约》内容的计划。经过一番热情欢迎，威廉·梅特兰完全不浪费任何时间，马上将玛丽·斯图亚特是否能成为英国下一任女王事宜搬上台面。而伊丽莎白女王明显露出失望神色。
“我原期待着贵国女王有其他要事，”伊丽莎白女王说，“这些花言巧语我听多了。”“不，”她继续表示，她“并不想讨论有关王位继承问题”。
“我死了以后，谁最有合法性，就由谁来继承王位，”她当场宣布，“若贵国女王恰好符合这个条件，绝对不会让她失望；若他人有更高的合法性，要我伤害这样的合法性，一点也不合理。”虽然她勉强承认自己并不知道有谁比玛丽·斯图亚特更适合，但她还是不想公开自己的意图，这样可能会危害自己的安全，毕竟“人们膜拜的是旭日东升，而非夕阳西下”。她并不反对立玛丽·斯图亚特为王位接班人，只是亨利八世的继承法可能会妨碍她这么做，且无论玛丽·斯图亚特提出什么样的主张，都得经过国会讨论。“毕竟我是嫁给了这个王国，当我宣誓时，便已无法改变国家法律。”伊丽莎白女王如此提醒威廉·梅特兰。女王继续表示，最好是让苏格兰当个友善的邻居，这样就可以赢得英国民心；他们就更有可能将她视为合法的王位继承人。
尽管如此，此事依然危机四伏。
“也许我会喜欢我的裹尸布，但自古以来，统治者怎么可能关照将继位的孩子呢？”伊丽莎白女王如此断言，“我姐姐在位期间，我对这种事情的体会可多了，有多少人渴望让我掌权？又有多少人忙着想要陷害我？身为一个统治者，身系家国希望，永远都寝食难安。若让各国知道未来谁将接下我的王位，我就永远不得安宁了。”
从玛丽·斯图亚特的观点来看，这个答案无法满足她；尽管如此，对于她的要求来说，伊丽莎白女王已经摆出最友善又合理的态度，这也为两位女王开启了更多真诚交心的机会。
九月十七日，伊丽莎白女王再度去信给苏格兰女王玛丽·斯图亚特，要求她核准《爱丁堡条约》，但威廉·梅特兰在第二次谒见伊丽莎白女王时，态度显得更为强硬，他对伊丽莎白女王提出警告，若玛丽·斯图亚特无法成为英国王位的继承人，可能会采取强制行动。他提醒伊丽莎白女王：“尽管女王陛下认定自己的地位合法，但欧洲各国显然不是这么想。”梅特兰大使如此赤裸裸的要求，仿佛想要从她身上强行得到她愿意重新考虑并更改《爱丁堡条约》的保证，显然这让女王感到不安。塞西尔自然也对此感到不悦，毕竟《爱丁堡条约》是他的心血。而正因为苏格兰女王的天主教信仰与对英国王位的觊觎，塞西尔一点也不信任玛丽·斯图亚特，他也曾坦率地直接向伊丽莎白女王挑明这一点，伊丽莎白女王旋即对于自己透露太多口风感到后悔不已。
到了十二月份，她不断要求，希望与玛丽·斯图亚特尽快一会，以讨论彼此之间的分歧，她再度执笔写信给玛丽·斯图亚特，亲自提议两人相见。玛丽·斯图亚特以热情的态度响应，表达自己对于与“最亲爱的姐妹”当面相见，感到欢欣期待，并且不断向托马斯·伦道夫询问有关伊丽莎白女王的问题，包括“她的健康情形、活动状况、饮食习惯与各式各样的问题”。看着表姑的画像，她表示“希望两人其中一人是男性，这样就可以通过联姻一统两国。”
“我想只要她们两人更熟稔以后，女王便可以就宗教问题，跟她（玛丽·斯图亚特）进行更多讨论。”梅特兰大使充满希望地告诉塞西尔。但他并没有说出他最担心的事，玛丽·斯图亚特的才智并不及伊丽莎白女王，这一点也是玛丽·斯图亚特的智囊们最大的顾虑。但要让两人见面，并非一夕之间便可成行，在接下来数月的书信往返与外交协商下，两国的女王都越来越等不及，她们非常期待能够见面。
梅特兰大使写信给塞西尔道：“我国女王醉心于欢欣的情绪中，一直期待着能够与她表姑会面，完全不需要任何劝说，但她的意念实在太坚决，顾问们都不敢提出建议。”苏格兰与英格兰的贵族们，对于提供资金让玛丽·斯图亚特正式出访英国，皆激烈反对，伊丽莎白女王的智囊们也用法国政界反玛丽·吉斯的声浪来警告她，显然法方也反对玛丽·斯图亚特此行。但伊丽莎白女王并不听从，对她来说，和玛丽·斯图亚特相见可以得到的好处很多，这份希望早已超越冒犯法国的风险。
伊丽莎白女王如此渴望会见小表亲，背后其实也有令人得以信服的个人因素。伊丽莎白女王是个极度自负的人，她非常好奇地想要知道，玛丽·斯图亚特是否如传闻中的那么貌美，而且她非常希望答案是否定的。对于玛丽·斯图亚特那使欧洲男性倾倒追求的名声在外，伊丽莎白女王很是嫉妒，她无法忍受玛丽·斯图亚特的争宠。当一名德国籍大使告诉她，据传玛丽·斯图亚特是个非常美丽的女人时，伊丽莎白女王立即回嘴表示不相信，因为“她绝对比苏格兰女王还要优越”。
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在英国方面，伊丽莎白女王顺利度过了达德利丑闻的灾难，继续维持声望。一五六一年九月八日，当她准备入住伦敦的圣詹姆士宫时，约有一万人来到现场想要亲眼看看女王，“这些人都非常高兴，也非常喜欢她”。
那一年的秋天，瑞典埃里克王再度提出要求，盼能与伊丽莎白女王共结连理。尽管那一段时间伊丽莎白女王积极鼓励他，但根据夸德拉大使表示，女王这么做的目的，只是为了避免埃里克王将目标转向苏格兰女王玛丽·斯图亚特。但要不了多久，就连这个勇敢无畏至今不渝的追求者，也对她失去了兴趣，放弃了追求。七年后芬兰约翰公爵罢免埃里克王，并在一五七七年谋杀了他。
达德利的命运依然在走下坡。一五六一年十一月时，有人看到伊丽莎白女王乔装打扮，从后门溜出怀特霍尔，去看他的射箭比赛。十二月二十六日，伊丽莎白女王让他的兄弟安布洛斯·达德利恢复华威伯爵（Earldom of Warwick）的地位，这是过去达德利的父亲与已故兄长的爵位。此外，女王还赐予华威城堡与英国中部的大片土地，而十二月二十二日时，达德利成为伦敦律师学院中的内殿律师学院成员，并在一场土地纠纷中提供证据。五天后，他在律师学院的大厅主持了一场壮观的集会，这一切都只为了一件事，让女王得以嫁给达德利。
达德利本人则时常希望丑闻能有雨过天晴的一天，但萨克森公爵派出的大使曾向主公转告，伊丽莎白女王向他透露：“从未想过与达德利结婚，但她对他的喜爱，比起其他人更甚，因为在她姐姐在位期间，所有的人将她孤立时，达德利对她的友善与注意力却从未减过一丝一毫，甚至还卖掉自己的财产，在经济上援助她。她只是认为，针对他的信赖与持续的关怀，自己应该涌泉以报。”
但达德利要的不只这些。一五六二年一月，他再度寻求夸德拉大使的帮助，要求菲利普国王写封推荐信支持他追求伊丽莎白女王。这次他并未再用假装自己要改信天主教的手段来欺骗西班牙方面，只是暗示法国方面提出一份丰厚的贿赂，希望他运用自己在女王面前的影响力。但夸德拉大使才不想被骗第二次。他只是圆滑地表示，女王陛下知道菲利普国王非常希望看到她出嫁，同时女王也知道，菲利普国王对达德利有很高的期待。因此要请主公写一封推荐信，绝对是无意义之举。在夸德拉大使的眼中，两人成婚最大的绊脚石其实是女王在婚姻议题上捉摸不定的心意；但若达德利希望的话，大使愿意再与女王谈谈这个话题。
达德利的确这么希望，于是不久之后，夸德拉主教便向女王询问，在婚姻议题上她是否已经下定决心。
“我与初生之日一样，在婚姻关系上孑然一身。”她告诉他，同时强调，自己已经决心不接受任何素未谋面的追求者，这也代表她非常清楚，自己可能只能嫁给英国人了，“也就是说，她认为找不到比罗伯特·达德利更适合自己的人了”。她继续表示，自己最希望的就是接到友善的他国国王来信，像是菲利普国王，建议她嫁给达德利，这样她的臣子们才不会指责，她是为了自己的私欲而选择达德利。这一点，她表示，也是达德利所希望的。
毫不令人意外的是，夸德拉大使对她的动机感到十分怀疑，并且“以一种开玩笑的方式”回避了她的问题，还建议她不要犹豫太久，应该赶紧满足达德利的要求，而且他知道菲利普国王将因此感到欣喜。事实上，夸德拉大使与菲利普国王都知道，伊丽莎白女王一旦下嫁达德利，将会牺牲地位与名望，动摇她的王权，甚至让天主教有机会在英国复辟——就像现在英国以北的苏格兰一样。
就在此时，伊丽莎白女王将当年他父亲的许多封地，全都归还给达德利，让他能够维持自己的地位。当年稍晚，女王授予他一份利益丰厚的执照，让他可以免税出口毛料。此举再度引起新一波的流言，认为女王将嫁给他。但到了六月时，伦敦出现传闻，指称女王与达德利在友人潘布鲁克伯爵（Earl of Pembroke）于伦敦的住处贝纳德城堡秘密结婚。女王觉得这样的传闻非常有趣，同时以取笑夸德拉大使为乐，告诉他寝宫侍女们都在询问，现在他是否该像亲吻女王一样亲吻达德利的手。而达德利本人则公开表示，伊丽莎白女王已经应允要嫁给他，“只是不在今年”。
英国国会指控夸德拉大使为散布谣言的始作俑者，但他否认这样的行为，仅表示自己因为无法告诉大家女王已婚的讯息，甚感抱歉。
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一五六二年春天，莱诺克斯伯爵夫人与儿子达恩里勋爵，终于脱离在伦敦家中遭软禁的惨况，再度成为女王跟前的红人。但莱诺克斯伯爵夫人是个野心勃勃的女人，不久之后，她又开始积极做媒，想撮合达恩里勋爵与玛丽·斯图亚特，借此融合两股问鼎英国王位的势力。然而这样的可能性早已触动伊丽莎白女王的敏感神经，只是这次莱诺克斯伯爵夫人实在太过火了，她的计划暗示着要推翻女王。计划很快便曝了光，而她那疑似叛国的计划，让她遭到逮捕成为伦敦塔中的囚犯。
到了五月，经过数月的协商触礁，玛丽·斯图亚特再度派遣威廉·梅特兰大使前往英国，要他带上口信，希望促成英方尽快邀请她进行外交访问。伊丽莎白女王告诉梅特兰大使，她绝对不会让任何事情延宕与玛丽·斯图亚特的会面，心情大好的玛丽·斯图亚特于是去信给吉斯公爵：“我猜你想象得到，当世界看到我们俩——英国女王与我——相处得如此融洽，会有多么震惊！”
不幸的是，法国爆发了一场天主教与胡格诺教派之间的冲突，尼可拉斯·瑟洛摩顿爵士与罗伯特·达德利便呼吁伊丽莎白女王全力支持遭受到胁迫的胡格诺教派人士，之后这些人也许就能协助她夺回加莱港以实现她内心最渴望的一个梦想。瑟洛摩顿爵士提醒她，与天主教忠仆玛丽·斯图亚特见面，或是与吉斯公爵的任何关联，在此时都不合时宜。