一五六五年十一月份，莱斯特伯爵与诺福克公爵间的“大冲突”，达到史无前例的高点。两边派系人马开始穿上专属制服，莱斯特伯爵的支持者皆穿紫色，而诺福克公爵与萨赛克斯伯爵阵营则以黄色为主。这些派系中的新血，都倾向诉诸暴力与叫嚣来解决分歧，两边阵营的紧张情势一度危急，让萨赛克斯伯爵向女王投诉他的太太有生命危险。
伊丽莎白女王非常清楚，自己对莱斯特伯爵的偏袒，就是这些麻烦事的问题根源，然而莱斯特伯爵甚至吹嘘自己是个“有女王陛下撑腰，便什么也不用倚靠的男人”，让事情更加恶化。女王曾在谒见室中公开警告他，要他不要表现得与女王太过亲近，招致妒忌，盼能化解纷争。
这次她亲自担任这些派系之间的协调者，坚持要双方放下争执。亨利·西得尼爵士从爱尔兰写信给莱斯特伯爵：“听说您最近做出极大退让。”但他却同时煽风点火：“也许您与对方能装作表面和谐，但在确定之前别轻易相信，因为这样的信任通常都会带来背叛。”宫廷中许多人也有相同的看法，在双方谦恭有礼的虚假外表下嗅到火药味。
是月，德·富瓦大使发现，莱斯特伯爵依然疯狂追求女王，而莱斯特伯爵的对手们也感觉与他假装友好非常容易。诺福克公爵却是唯一的例外。
十二月初，诺福克公爵觐见女王，他趁这次机会大大鼓吹婚姻的好处，以及稳定继位问题带来的利益。他向伊丽莎白女王表示，英国宫廷中多数有权的臣子都希望她嫁给查尔斯大公。若有人支持女王与莱斯特伯爵成婚，也是因为他们认为这是女王心之所向，“绝不是因为他们认为这段婚姻能为英国带来任何利益，或对女王的尊严有任何帮助”。伊丽莎白女王一直以礼貌的态度聆听诺福克公爵的说法，但却拒绝说出任何确定的答案，接着她答应了诺福克公爵退下的请求，这次的会面才结束。
很快，在那之后，诺福克公爵去找莱斯特伯爵，并警告他别忘记自己前一年夏天允诺过放弃对女王的追求。莱斯特伯爵非常克制地不与他发生龃龉，诺福克公爵接着带着自己为王权与国家争一口气的骄傲返家。
这一年的圣诞节，莱斯特伯爵信心满满地，再一次请求女王嫁给他。女王一如往常地回以模棱两可的话，故意要他等到二月份的圣烛节才有答案，但接下来几天，女王似乎非常认真地思考他的求婚。宫廷中流言满天飞，而莱斯特伯爵则大大利用了他成为亲王的可能性，在这段时间内树立了更多敌人。德·富瓦大使则私下向唐迪亚哥大使发誓，“女王在新年之夜一定与莱斯特伯爵上床了”，但唐迪亚哥大使并未完全采信他的说法，认定这是他居心叵测想要践踏女王的贞操，破坏女王与哈布斯堡王朝联姻的机会。
在主显节时，因为希尼治爵士被选为“第十二夜国王”，整夜都将由他来主持宫廷宴席，因此莱斯特伯爵与他爆发了新一轮的冲突。在进行一个益智游戏的时候，希尼治爵士逼迫莱斯特伯爵问女王，心里最难消除的是什么？——是妒忌还是恶意搬弄是非的人散播的邪恶想法。
“罗伯特·达德利伯爵因为不便拒绝，只好服从。女王礼貌性地表示两者都很难消除，但对她个人来说，妒忌更是难以抹去的情绪。”莱斯特伯爵以为这句话是冲着他来的，女王故意暗示莱斯特伯爵对她不忠，于是莱斯特伯爵给了希尼治爵士一个口信，表示因为他无理的举动，将“用棍棒来惩戒他”。希尼治爵士于是反驳：“这样的惩戒一点也不公平，若罗伯特·达德利伯爵冒犯了他，将会尝到他的剑有多利。但罗伯特·达德利伯爵却只回答，希尼治爵士不是他的对手，因此他会把惩戒的时间，延后到他认为适当的时机。”法国大使表示，希尼治爵士向女王告了状，让女王对莱斯特伯爵感到气恼不已，甚至向他发飙，“若因为她的宠爱，让他变得如此傲慢无礼，他应该尽快改正态度，否则女王能提拔他也能贬谪他”。“陷入忧愁”的莱斯特伯爵，接下来几天都关在房里足不出户，他这样的举动达成了预期的效果，让女王的怒气很快就变成了原谅。很快，威尼斯方面就出现了相关传闻，指出伊丽莎白女王想册封他为公爵，并嫁给他。圣烛节来了又走，女王这边却杳无音讯，很快大家就明白，伊丽莎白女王只是又使了她最著名的一招——拖延战术。
诺福克公爵依然决心要将莱斯特伯爵斗倒。表面上，两人都尽心尽力地想要维持友好，但两人彼此之间的憎意依然十分明显。因此当法国国王出于对嘉德勋章的感谢，准备要授予伊丽莎白女王的两位臣子圣米迦勒勋章殊荣，并且人选由她决定时，她提名了莱斯特伯爵与诺福克公爵，典礼时间就定在一月二十四日。
诺福克公爵怨恨莱斯特伯爵得到的一切荣耀，于是拒绝参加，经过女王多方说服才让他答应出席。典礼当天，诺福克公爵与莱斯特伯爵穿上了白色与黄褐色的天鹅绒礼袍，装饰着金色与银色蕾丝绲边，两人先在怀特霍尔宫的“大议事厅”等待，接着才前往进行授勋仪式的礼拜堂。在两人礼貌周到的外表下，憎恨的情绪已到达沸点。女王对此授勋仪式也意兴阑珊。在法国方面将这个勋章赠予达恩里勋爵后，女王便发现圣米迦勒勋章如此浮滥地发给了太多人，也降低了圣米迦勒勋章本身的价值。
典礼过后不久，诺福克公爵从塞西尔处听闻女王的宠臣完全忽视自己的诺言，依然持续追求行动，诺福克公爵于是去找莱斯特伯爵，坚持要他放弃任何一丁点儿想要娶女王的意图。除此之外，更重要的是，他必须支持哈布斯堡王朝的联姻计划。莱斯特伯爵同意尽可能地帮忙，但前提是不能让伊丽莎白女王觉得自己不喜欢她，这样她可能会“发女人脾气，毁灭他”。他非常信守承诺，真的跑到女王跟前，要求女王为了自己也为了国家着想赶快结婚，当然也可以阻止别人继续诬赖他阻挡女王的婚姻之路。
不久之后，伊丽莎白女王在一次与唐迪亚哥大使在怀特霍尔宫的私人花园散步时，因为莱斯特伯爵无私地要伊丽莎白女王为了英国尽快结婚而向大使出言盛赞。事实上，阻挡女王婚姻之路的，并不是她对莱斯特伯爵的私情，而是哈布斯堡王朝君主不答应她的条件。一月份，当马克西米连二世要求她放松条件时，她依然紧守底线，表示若自己嫁给一个不同信仰的男人，将会造成“千千万万个麻烦事”。
莱斯特伯爵真正的感受随后也浮出台面，当伊丽莎白女王沉醉在与欧蒙德伯爵的调情之中时，莱斯特伯爵生气了。他与女王吵了一架，什么目的也没达成，愤而离宫。诺福克公爵也离开了，一直在乡间待到九月。
莱斯特伯爵受够了。他厌倦了冲突与诡计，同时对于自己因女王不婚而遭到的指控感到郁闷。人们以为他大大地影响了女王的决定，但其实根本不是。他成为政府运作失当的代罪羔羊，但政府运作成功时的归劳都归功于女王，与他无关。在他离宫的那段时间，塞西尔与瑟洛摩顿爵士，为他提供国家与宫廷内许多情报，他向塞西尔透露自己对于女王能好好结婚，一点也不抱希望；瑟洛摩顿爵士则建议他远离宫廷，以免成为众矢之的。他的确没有回宫的打算，对女王的脾气及女王要他演出的累人的追求戏码也都倒尽了胃口。
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一五六六年二月，达恩里勋爵听闻里奇欧总待在玛丽·斯图亚特房中，和她进行“秘密活动”，而且还可能是她腹中那未出世的孩子的父亲（这个传闻到了十七世纪初期依然广为流传），再也受不了太太背叛自己的所有传言；同时他也不想再忍受作个无实权的国王。于是他向身边的人清楚表明，自己除了得到执政王权之外，什么也不要，若有人能协助他成功达成目标，他就会竭尽所能地协助苏格兰新教。对于那些肆无忌惮的苏格兰领主们而言，他们一致地讨厌里奇欧秘书的影响力，希望他和达恩里勋爵远离苏格兰政治圈，而这个提议正好让达恩里勋爵如同待宰的羔羊。看来年老体衰的拉斯文勋爵帕特里克（Patrick，Lord Ruthven）与摩顿伯爵（Earl of Morton）是主要共谋，但许多证据强烈显示他们只是挂名，来掩护背后流亡的莫雷伯爵与反叛军的行动，而后者正暗中蛰伏，希望能重新站上权力的浪头。
这些共谋的人决定在苏格兰女王的面前刺杀里奇欧：他们知道玛丽·斯图亚特已经怀孕六个月，从而希望能因而伤害她与未出世的孩子，让她变得无生育能力。在领主们表面上的支持下，达恩里勋爵便开始妄想自己被立为亲王，或者万一玛丽·斯图亚特死于生产过程，他就能成为摄政王，甚至取而代之坐上王位。无论玛丽·斯图亚特未来命运如何，他都认为自己将在苏格兰称王，就算她身心健全地在政变中存活下来，胎儿也未受伤害，叛党们表示，可以随达恩里勋爵高兴，将玛丽·斯图亚特囚禁在史特林城堡中。
但达恩里勋爵的同党们有其他的计划。他们想在时机确定的时候，演一出戏给玛丽·斯图亚特看，让她以为达恩里勋爵独自策划谋杀里奇欧的计划，而且还试图想要伤害她，以煽动玛丽·斯图亚特判他叛国罪——最终将处以极刑。这一石二鸟之计，将为他们一次除掉两个不受欢迎的眼中钉。
托马斯·伦道夫在苏格兰宫廷中听到消息，于是在二月十三日通知了莱斯特伯爵：
我非常确定，现在的苏格兰女王对这场婚姻感到后悔莫及，她彻头彻尾地痛恨她的丈夫。我也知道，若宫廷中的谋反计划真的进行顺利，在女王丈夫的同意下，戴维·里奇欧十天内便会人头落地。更多令人悲痛的肮脏事，不断传进我耳里——甚至还有对付苏格兰女王本人的计划。
莱斯特伯爵并不想如实回报。尽管如此，塞西尔与英国枢密院也已经发现这个谋刺计划，也猜测出苏格兰女王将遭受的伤害。但一直到叛党行动之后，伊丽莎白女王才知道：三月六日，伦道夫便要求塞西尔通知女王谋反计划，但他的信件并未及时送达伦敦。
叛党们原定于三月十二日进行谋刺计划，但因担心伦道夫背叛他们，因而提前三天行动，以免伊丽莎白女王插手阻拦。一五六六年三月九日，拉斯文勋爵带着一批持械男子进入荷里路德宫，这时怀孕六个月的苏格兰女王玛丽·斯图亚特与阿盖尔小姐和里奇欧正在用膳，里奇欧虽身在女王面前，却并未依照礼俗脱下帽子。突然间达恩里勋爵、手持武器的拉斯文勋爵和一群人闯入房里，将女王推向一边，抓住了意大利籍的秘书里奇欧，里奇欧随即大喊：“侍卫！侍卫！快救我，我的夫人！”同时一手抓住了玛丽·斯图亚特的裙摆。持械男子将他拉开，接着他被拖进隔壁房间，被以残忍野蛮的手段谋杀了，死时身上有五十六处刀伤。玛丽·斯图亚特被人强行压制以免她前去营救，后来她表示其中一名叛党，拿着上膛的手枪对着她隆起的肚子。当她询问达恩里勋爵为何做出“如此缺德的肮脏事”时，他破口回骂表示“这两个多月来，她陪伴戴维的时间比陪他还多”。
在震惊之中，苏格兰女王玛丽·斯图亚特被幽禁在房中，但接下来的两天内，她设法说服了她那不太聪明的丈夫，这群叛党接下来要谋杀的目标就是他。达恩里勋爵被吓得惊慌失措，背叛了所有参与谋刺计划的叛党人士，玛丽·斯图亚特随即明了，这场反叛行动真正的目标是她。三月十一日子夜，苏格兰女王夫妇从后方的阶梯悄悄离开，穿过仆人们的住处逃离了皇宫，跨上马，飞也似的在夜里穿梭了二十五英里，终于抵达敦巴。
苏格兰女王在敦巴决定为里奇欧之死复仇，于是召集了八千人的军队反攻爱丁堡，终于在三月十八日重新夺回首都控制权。然而叛党们早已逃离爱丁堡，并且热血沸腾地准备报复达恩里勋爵的背信弃义。不久之后，玛丽·斯图亚特便发现达恩里勋爵涉入里奇欧之死的程度甚深，夫妻两人之间的短暂的和解至此戛然而止。两人的感情至此破裂，玛丽·斯图亚特将达恩里勋爵排除在所有政务之外。尽管他仍住在宫中，但总被视为一个乖戾愠怒又危险的麻烦人物，而且持续受到监管，以免他又涉入任何阴谋中。
当玛丽·斯图亚特从敦巴寄出一封充满情绪与画面的信件，通知伊丽莎白女王里奇欧之死与达恩里勋爵涉案的情事时，伊丽莎白女王对玛丽·斯图亚特遭受的一切磨难，感到十分惊恐。伊丽莎白女王将玛丽·斯图亚特的一幅缩小画像挂在腰间，召见了唐迪亚哥大使，花了整整一个小时与他讨论这件邪恶的事情，她告诉唐迪亚哥大使：“若我是玛丽·斯图亚特，我一定会拿起丈夫手中的那把剑刺向他。”她随即想起自己谈论此事的对象是唐迪亚哥大使，于是很快地加上一句，自己绝对不会这样对待查尔斯大公。
返回爱丁堡后，玛丽·斯图亚特发现莫雷伯爵表示愿意协助她。她在危险中的表现让莫雷伯爵大为激赏，莫雷伯爵花了一番工夫说服她，自己站在她那一边。她让莫雷伯爵重回议事厅堂，在她怀孕后期，莫雷伯爵渐渐地成为苏格兰实际上的统治者，也让自己能与伊丽莎白女王匹配。苏格兰贵族们不想再与达恩里勋爵啰唆，毫不掩饰他们对他的轻视。
苏格兰发生的恐怖事件，让伊丽莎白女王为玛丽·斯图亚特感到十分忧心，于是要她放下双方歧异，因此有一段时间，两位女王间的关系大有进展。两位表亲再度鱼雁往返了一段时间，伊丽莎白女王扮演较年长、较有智慧的姐姐角色，提供许多宝贵意见，同时也为玛丽·斯图亚特祈祷，希望她生产时经历短暂痛苦获得甜美果实。“我，”她表示，“也‘怀着’极大的期待，盼望听到好消息。”玛丽·斯图亚特充满感激之情，于是献给伊丽莎白女王一个最大的荣耀，询问她是否愿意当孩子的教母。
玛丽·斯图亚特对这位“最亲爱的姐妹”如此努力促成她的愿望十分感激，英国王位继承问题的紧张情势，似乎也减缓不少。在玛丽·斯图亚特的眼里，查尔斯大公是最适合表姑的配偶人选，于是热切地为联姻计划背书。
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伊丽莎白女王与莱斯特伯爵的冷战只维持了两星期：一如往常，女王无法忍受没有他的生活，到了三月底，因为“讨厌”他不在的日子，女王派了一位侍女桃乐丝太太，前去告诉他：“你那轻率的举动影响了她，女王陛下因你长时间不在而变得苛刻。”四月一日，莱斯特伯爵便重返宫廷，在伊丽莎白女王表示再也不让他离开自己身边后，两人再度和好。
塞西尔暗自说服自己，要让女王对宠臣的感情顺其自然，他努力调整心情，接受女王可能嫁给莱斯特伯爵的结果，但他自然对这样的发展不太满意，不只是他的个人因素，还因为他深深相信，两人成婚无法为英国带来任何益处。四月份时，他着手制作了一张图表，将莱斯特伯爵与查尔斯大公做比较，在每一个评比的项目中，莱斯特伯爵几乎都输：他出身平凡家庭，在“财富、受人敬重的程度与权力”上，他样样都无法为这段婚姻加分；他与前妻并未生子，他可能也无法生育。这可能是“一段充满色欲的婚姻”，这样的婚姻始于放荡将终于伤痛。查尔斯大公“受人尊崇”，而莱斯特伯爵则“受许多人唾弃，还因前妻之死蒙羞”。若他娶了伊丽莎白女王，“世人将认为有关伊丽莎白女王与莱斯特伯爵之间的流言蜚语都是真的”。
就如以往在信件中的坚决般，塞西尔总认为这些流言是错误的；他也深信，时间一久，伊丽莎白女王将会接受与哈布斯堡王朝的联姻，他总是在心中祈祷，神会将她的心导向这个方向，否则她统治之下的英国将充满麻烦、不平静。
然而莱斯特伯爵并未在宫中待太久。他与女王之间依然冷淡，传闻甚至指出，女王打算免去他骑士统领之职责。到了四月底，女王让莱斯特伯爵前往诺福克郡的庄园，但莱斯特伯爵这次的离开，并未获得女王的善意对待，女王写了一些尖酸刻薄的责难，但相关证据至今已荡然无存。震惊不已的莱斯特伯爵转而告诉瑟洛摩顿爵士：
我收到了你（的信件）和另一封向来能带给我极大安慰的信，但现在我也不知道该如何区分这些音讯。若能在我身上找到任何起因，便是我活该，我愿面对更糟的惩罚，然而没有任何人能坚持像我一样离错误如此遥远，我非常清楚，自己绝无犯错：我从未刻意冒犯。人总会犯错；我只希望那唯一最重要的人能原谅——是的，遗忘——我。若长久以来的服侍与多年的表现，仍不能证明坚定不移的忠诚，我又该如何相信过去的这些宠信，一时的错误就毁去了过去建立的一切吗？
他实在太过沮丧，甚至表示：“我现在只想蜷缩在一个被遗忘的洞穴角落，或可以长眠的坟墓中。”
女王再一次将他召回宫中，他不耐烦地回去，但女王想与他和解，不久后，他又再度回到最受宠的位置。
五月份，伊丽莎白女王总算同意，派遣塞西尔的妻舅汤玛士·丹奈特（Thomas Dannett）前去奥格斯堡与哈布斯堡王朝君主斡旋，女王表示若哈布斯堡王朝君主同意让查尔斯大公访英，他与女王之间的婚姻协商，就再也没有任何阻挠。然而马克西米连二世依然执著于宗教问题，于是原本计划赠予其嘉德勋章的伊丽莎白女王，决定在对方态度软化前延后赠予计划。
丹奈特特使也在维也纳见到查尔斯大公本人，并向女王回报大公本人殷勤有礼、友善可亲、变通不守旧、博学多闻、十分得人心，也非常喜欢户外运动；曾得过天花而幸存，但天花并未减损他的帅气。“身为一个男人”，他显得“十分俊俏，长相好看，体格健美，腰围小，胸围宽阔；尽管穿着全副服装，依然看得出大腿与小腿比例完美”。尽管“有一点伛偻”，他骑马时依然挺拔。唯一的缺点是对宗教信仰虔诚，可能永远也不会改变自己的信仰。丹奈特特使希望女王对查尔斯大公私下参与弥撒仪式“睁一只眼闭一只眼”，但女王却固执地拒绝了。丹奈特特使一直在奥地利待到八月，徒劳地等待女王改变心意，但他却只等到女王要一张画像的要求。
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六月十九日，在戒备森严的爱丁堡城堡中，苏格兰女王玛丽·斯图亚特经过漫长又痛苦的生产过程，终于产下一个健康的男婴詹姆士，也大幅增加了她继承英国王位的可能性。从此她对英国王位的企图，不再只是为了自己，还为了她的儿子。
数十年后，詹姆士·梅尔维尔爵士的回忆录引用了一个来源不明的故事，指出伊丽莎白女王对詹姆士出世的反应。对于当时的她，梅尔维尔爵士表示：“展现出极大的欢乐之情，在晚膳后开心跳舞。”六月二十三日，当塞西尔悄悄地告诉她这个消息，“听闻消息后，她悲怆地跌坐，猛然对着侍女们大喊，苏格兰女王已经是个男孩的妈了，而她却只是个不会下蛋的母鸡”。但梅尔维尔爵士并未亲眼见证此事，仅表示自己是听闻宫廷中的朋友转述，但当时他却未记录下来，现代也未有当时留存下来的相关证据以资证明。而梅尔维尔爵士向玛丽·斯图亚特转述伊丽莎白女王的反应时，仅表示王子的诞生“让女王陛下感激不已”。事实上，在梅尔维尔爵士抵达之前，塞西尔便已先行告知女王此消息，而唐迪亚哥大使则称：“女王对于新生儿的诞生显得相当高兴。”