一五六七年二月十日凌晨两点，爱丁堡市区传出了猛烈的爆炸声响，许多人仓皇来到柯克欧菲尔德宫，却只看到无情的火焰将柯克欧菲尔德宫烧成灰烬，而在果园中则找到身上仅着睡袍的达恩里勋爵与他的随从泰勒的尸体。两人颈上的痕迹显示皆系被勒死：两人显然并非因爆炸而死，爆炸可能只是为了摧毁谋杀的相关证据。许多人认为，达恩里勋爵可能感到不对劲，与仆人一同离家察看，结果在外头遭到攻击。一名年老的邻人曾听到他呼喊：“兄弟，可怜我吧！以怜悯所有人的神之名！”在爆炸声响过后，第一个跑到街上的人是威廉·布雷艾德队长，他是玻斯威尔侯爵的人，随后他遭到逮捕，但他发誓自己只是在附近与朋友把酒言欢。
苏格兰女王当晚也被爆炸声惊醒，当她听闻达恩里勋爵死亡的消息，表示感到震惊与恐惧，并矢言以最快的速度揪出杀夫凶手加以严惩。她同时也认定这个凶手的目的，也是杀害她：若她未前往荷里路德宫参加婚礼，便可能惨遭不测，于是她一点时间也不浪费，随即着手撰写信件给各国皇室，宣布自己“奇迹般”死里逃生。
达恩里勋爵毫无疑问是遭到谋杀：许多人都有陷害他的动机，他的死也让许多人有机可乘。其中最主要的就是女王，她早已不爱达恩里勋爵，而且想方设法要亲自除掉他。她也认为达恩里勋爵有不良企图，最近她甚至向詹姆斯·毕腾大主教（Archbishop James Beaton）抱怨，丈夫企图绑架儿子统治国家。
玻斯威尔侯爵也想害死达恩里勋爵，这样他才有机会迎娶女王，统治苏格兰。他是一个“夸大自负的人，有着难以想象的骄傲、凶恶与虚荣，为了自己的野心，什么事都做得出来”。这是当时的一位人士对他的形容。
还有其他苏格兰贵族，也都十分厌恶达恩里勋爵，在里奇欧死后，这些贵族人士总认定达恩里勋爵背叛了他们。对疑犯的推论，甚至衍生到对苏格兰有非分之想的外国贵族：包括天主教领导者菲利普二世、查理九世与罗马教皇，他们都不希望看到达恩里勋爵的丑闻糟蹋了天主教的风气。相反，伊丽莎白女王则急切地想要在苏格兰扩展新教优势，尽管有莫雷伯爵主导，但达恩里勋爵依然是个障碍。
但对苏格兰与欧洲各地的贵族来说，多数人都认为证据指向玻斯威尔侯爵，而且很快就牵连到玛丽·斯图亚特。
二月二十四日，伊丽莎白女王即将收到来自苏格兰卧底的回报，指出达恩里勋爵之死的背后，比起官方公布的说法有更邪恶的动机，于是伊丽莎白女王从怀特霍尔宫非常紧急地写信给玛丽·斯图亚特。取代以往信件“亲爱的姐妹”的开头，她写道：
女士：
听闻你的前夫遭到令人毛骨悚然又恶劣的手段残杀，让我连耳朵都竖直了，我的心也在颤抖，他是我们共同的表亲，让我难过得几乎无法提笔写下此信；但我仍无法隐藏，自己对你的怜悯多于他的事实。我希望能协助我那信仰虔诚的表侄女与挚友，因此我得叮咛你保持你的傲气，千万不要如多数人说的一样，动手报复那些对你坏的人。我必须规劝你，给你忠告，我请求你将我的话放在心上，未来碰上了任何困境，你便将不致恐惧。我热切地写下此信，并非质疑你，而是出于情感所趋。
法国王太后凯瑟琳·梅迪奇则向她周遭的人表示，玛丽·斯图亚特能摆脱那傻子，简直就是天降的福气，但同时提醒她的前儿媳，若她不尽快找出凶手并加以严惩，法方将视它为污点，并成为她的敌人。
玛丽·斯图亚特积极想要摆脱与此案的关联，下令展开调查，但目击证人具结书都在可疑的情形下节录，甚至有人受到刑求。若同父异母的妹妹遭到推翻，莫雷伯爵便有可能坐上苏格兰王位，他负责统筹这些文件，因此这些证据全都不足采信。玛丽·斯图亚特可能是因为当时健康情形不佳因而变得优柔寡断，在达恩里勋爵死后几周内，也不愿主动对抗那个出现在爱丁堡的匿名公告中被指控为杀人凶主嫌的玻斯威尔侯爵。
达恩里勋爵的父母则陷入极度的痛苦中，不只因为儿子之死，还因为女王对于将罪犯绳之以法，似乎兴致缺缺。伊丽莎白女王将忧郁的莱诺克斯伯爵夫人从伦敦塔中释放出来，并将她交由理查德·萨克维尔爵士（Sir Richard Sackville）照料。唐迪亚哥大使则透露，莱诺克斯伯爵夫人一口咬定，玛丽·斯图亚特“某种程度上一定插手此事”，这都是为了“替她那个意大利秘书报仇”。莱诺克斯伯爵则成功地对玛丽·斯图亚特施压，私下起诉玻斯威尔侯爵谋杀达恩里勋爵，但在一次开庭中证人们因受到恐惧都不愿出席，最后玻斯威尔侯爵在四月十二日遭到无罪释放。
四月二十四日，再度从病中康复的玛丽·斯图亚特，前往史特林探望儿子后返回爱丁堡。玻斯威尔侯爵莽撞又不顾两人的声誉地——但也有可能是在玛丽·斯图亚特同意与事前知情的状态下，因为她拒绝其他人的援救——绑架了她，并将她带往敦巴，并“蹂躏”了她，以此确保玛丽·斯图亚特无法拒绝与他结婚的请求。
在绑架案过后不久，英国的格雷男爵（Lord Grey）带着口讯来访，要告诉苏格兰女王，对于她无法将杀夫凶手正法，反而展现出支持的意味，伊丽莎白女王感到“十分困惑”，“仿佛就如坊间传言般涉入此般罪行”。玛丽·斯图亚特当时被软禁，自然没有接到这个口信。当伊丽莎白女王听闻玛丽·斯图亚特委身于玻斯威尔侯爵时，感到惊愕万分。
六月三日，苏格兰教会因玻斯威尔侯爵与妻子的一名侍女通奸，因而将他逐出教会，同时也宣布他的妻子可合理离婚。此举也让玻斯威尔侯爵得以迎娶玛丽·斯图亚特。五月十五日，两人在荷里路德宫以新教仪式成婚。在那之后，玛丽·斯图亚特曾声称自己别无选择，但许多人认为她行为堕落，因而断定她与玻斯威尔侯爵联手谋害了达恩里勋爵。
伊丽莎白女王对玛丽·斯图亚特的举止深感遗憾，这次与她在艾咪·达德利疑遭谋害时的处理态度大相径庭，在一封写给玛丽·斯图亚特的信件中，她劝道：“女士，我们的友情以成功来维系，但逆境乃真正友谊之试金石，因此我必须说这些话。”她知道玛丽斯图亚特再婚的消息，于是说：
坦白告诉你，我们感到非常遗憾：你怎么会做出如此错误的选择，在如此仓促之下嫁给一个臣子，他除了各种恶名昭彰的缺点外，公众也将你前夫之死怪罪于他，尽管我们知道他侵犯了你，但我们都知道这是他的错。而且你嫁给他是件危险的事，毕竟他还有个合法的妻子，但你们两人却没有合法的子嗣！
你可以无视我们的看法，但我们深感抱歉，无法抱着更好的想法。我们将诚挚地致力于运用各种力量，将任何与贵国臣子为敌的凶手绳之以法，无论你与他之间有多亲密，接下来你都应该小心你的儿子詹姆士王子，保护他就是保护你自己与你的王国。
伊丽莎白女王向伦道夫表示，她“非常不欣赏苏格兰女王的作为，因为实在是太厌恶，因而为她感到羞耻”。而且伊丽莎白女王不支持这段婚姻，还有其他的原因。伦道夫一直以来总不断提醒伊丽莎白女王，“相较起任何人，玻斯威尔侯爵绝对是英国永恒的敌人”。伊丽莎白女王忧心，若满足了他的野心，他可能会煽动玛丽·斯图亚特与英国作对。贝福德伯爵也因此下达指示，“安抚”所有“痛恨玻斯威尔侯爵坐大”的苏格兰贵族。
婚礼两天后，玛丽·斯图亚特已经开始后悔自己的愚蠢，而事实也证明，玻斯威尔侯爵是个不良丈夫，对一些无聊的琐事常感不满，并对其他贵族的势力表现出嫉妒之意。法国大使看出她的忧伤，也听到她寻死的念头；她甚至有一度还想拿刀自残。但是他发现除了心理上的忧伤之外，玛丽·斯图亚特其实抵挡不了玻斯威尔侯爵身体上的诱惑。
苏格兰贵族们无法容忍这段婚姻。好不容易才摆脱了里奇欧秘书与达恩里勋爵，他们根本无法忍受野心勃勃又莽撞无礼的玻斯威尔侯爵来做苏格兰王，于是他们很快便准备要以武力对抗他。冲突于六月十五日发生在卡伯里山。这次起义鲜有溅血，那一天的冲突过后，玛丽·斯图亚特遭到贵族软禁，而玻斯威尔侯爵则逃回敦巴，随后再由奥克尼岛出境逃往丹麦。贵族们向女王保证，他们并不想伤害她，但她随即便发现，自己如同被囚困的重刑犯。
因此她在受到轻视的状况下，哭着回到爱丁堡，而她的臣子们对她的看法则是毫无保留。当她进入拥挤的街道时，人们辱骂她为淫妇、杀夫凶手，甚至有人大喊：“烧了这个贱货！杀了她！淹死她！”
“我要吊死这些人！折磨这些人！”她哭着说，但她的羞辱如此直接。街头更张贴了公告，将人鱼的形象——象征着妓女——加诸她身上，只要有机会便挑衅她。而她的王朝显然已经告终。
在遭到革除王权的两天后，玛丽·斯图亚特被关入位于金罗斯利文湖中岛上的一个城堡中。除了身上的衣服，她一无所有，在她被囚禁后几周内，她便流产失去了一对双胞胎，而且大失血，使得她不得不卧床休息很长一段时间。同时，玛丽·斯图亚特底下的贵族们，正用尽心机激起民众对她的反对声浪，并想方设法要处置她。
伊丽莎白女王听闻此事，对于臣子囚禁女王背后象征的意义感到忧心不已。无论玛丽·斯图亚特做了些什么——伊丽莎白女王对她的行为也深感遗憾，但她个人一点也不怜悯玛丽·斯图亚特——但玛丽·斯图亚特依然是神圣的君主，无论是“本质上或法律上”，人们都必须对她忠诚、服从，而苏格兰贵族们对她的态度，已经开了一个危险的先例。一个女王遭到迫害而放弃王权，这是完全无法想象的事情。更令人警醒的是，在英国也出现了许多为推翻玛丽·斯图亚特喝彩的歌谣。因此让伊丽莎白女王下定决心，要尽可能地努力救援玛丽·斯图亚特。
* * *
六月二十日，玻斯威尔侯爵的一位随从遭到逮捕，并被迫将后来被称为“首饰盒密函”的信件交给了摩顿伯爵。“首饰盒密函”是玛丽·斯图亚特与玻斯威尔侯爵两人鱼雁往返的数封密函，若能鉴定真伪，便能指控女王为杀人帮凶。贵族们则向玛丽·斯图亚特表示，她只能选择接受审判，且“首饰盒密函”定会成为重点证物，或是选择退位，要不然就是与玻斯威尔侯爵离婚。她拒绝接受这些选择，根据她的政敌们转述，她只希望能够搭上小船，与玻斯威尔侯爵一起出行，看看命运将他们带往何处。此时罗马教皇听闻她近来的行为，也在七月二日拒绝未来与她的任何关联。
七月初，伊丽莎白女王再度派遣瑟洛摩顿爵士前往苏格兰，希望能协助玛丽·斯图亚特与贵族达成协定，英方坚持由玛丽·斯图亚特复位。在完成任务后，他同时要求苏格兰方面找出谋杀达恩里勋爵的真凶，并将其绳之以法。最重要的是，他也确定了詹姆士王子的安危，毕竟他对伊丽莎白女王来说，也有王权上的重要性；若有必要，瑟洛摩顿爵士可以将詹姆士王子带回英国，由伊丽莎白女王保护他。瑟洛摩顿爵士曾告诉莱斯特伯爵“这是我政治生涯中最危险的一次出使任务”，他慢慢地朝北走，但随后却被皇室贵族赶上，以女王之名下令要他尽快赶路。
苏格兰的民众受到约翰·诺克斯的煽动，出现反玛丽·斯图亚特情结，同时苏格兰国内对于瑟洛摩顿爵士的干预也十分反感。他们禁止瑟洛摩顿爵士接近玛丽·斯图亚特，苏格兰贵族们甚至表示，若伊丽莎白女王不愿相助，便要处决玛丽·斯图亚特，并与英国断交向法国示好。瑟洛摩顿爵士唯一能做的，就是写一封信给玛丽·斯图亚特，建议她与玻斯威尔侯爵离婚。事情已经到了如此绝境，玛丽·斯图亚特依然拒绝。
苏格兰贵族不同意让詹姆士王子前往英国，现在他们决定要让玛丽·斯图亚特退位，由她的儿子继位。因为小产而使身体羸弱，她根本无力抵抗；然而在七月二十四日，当她被要求签署放弃王位的同意书时，她拒绝了，并要求召开苏格兰国会。林赛男爵（Lord Lindsay）威胁她若不从将割开她的颈项，她才屈从。五天后，她那还在襁褓中的儿子，便在新教仪式中，于史特林加冕成为詹姆士六世。加冕日那一天，利文湖也有疯狂庆祝的活动，而负责看守玛丽·斯图亚特的守卫们，则极尽所能地侮辱她。
七月二十七日，怒不可遏的伊丽莎白女王对瑟洛摩顿爵士下达指令，要他向苏格兰方面表达：“他们在《圣经》中找到什么样的正当理由，可以推翻自己的君主？在基督教王权中，他们又找到什么样的法律，记载臣子可以逮捕自己的君主，软禁君主，甚至还想审判君主？在任何法规中都找不到这样的规定。”若玛丽·斯图亚特是遭到胁迫下位，伊丽莎白女王威胁道：“我们一定会直接采取行动，对付他们，向他们的王权展开报复，为后世子孙立下典范。”
瑟洛摩顿爵士认为（他也曾向莱斯特伯爵表示），若有人试图营救玛丽·斯图亚特，都只会造成她惨遭杀害的命运，但同时也不会有人怀疑，若伊丽莎白女王并未以如此激烈的话语响应苏格兰贵族们对待玛丽·斯图亚特的方式，苏格兰贵族们可能早已将玛丽·斯图亚特处斩。能让玛丽·斯图亚特知道伊丽莎白女王积极为了她的安危着想，瑟洛摩顿爵士感到十分感激，“我想那可怜的女士一定知道”。然而对那些原为英国新教同盟的人士来说，因为伊丽莎白女王的干涉，现在双方关系降至冰点，大战一触即发。
尽管有引发战争的危险，伊丽莎白女王在只有莱斯特伯爵的支持下，依然决定要在此事件上取得胜利，因而无视瑟洛摩顿爵士与塞西尔的请求与警告，这两人希望能与莫雷伯爵保持友善关系，同时对于伊丽莎白女王仿佛着魔般想要使苏格兰顺从的想法，感到警觉不已。对于要求释放玛丽·斯图亚特一事感到不满，伊丽莎白女王决心尽可能地破坏莫雷伯爵建立稳定政府的努力。为了冷落莫雷伯爵，伊丽莎白女王故意召回瑟洛摩顿爵士，以展现自己不认同莫雷伯爵王权的态度。这不仅仅是个策略，但瑟洛摩顿爵士一直努力向伊丽莎白女王解释，莫雷伯爵其实早已手握大权，而大多数的苏格兰人都不希望令王权蒙羞的玛丽·斯图亚特复辟。莫雷伯爵对伊丽莎白女王很反感，也不把她当回事，他如此告诉塞西尔：“尽管贵国女王陛下、你的女主公似乎公开地表达对现况的不满，但我一点也不怀疑，在她心里其实很喜欢现在的状况。”
然而在八月十一日时，伊丽莎白女王因“颈部扭伤造成的疼痛”而大感脾气暴躁，向塞西尔说了“十分具有攻击性的话语”，严厉地斥责他与其他议员们，竟然想不到任何方法，可以协助她为苏格兰女王遭到囚禁一事进行报复，更无法将她救出。塞西尔说了些模棱两可的话后，伊丽莎白女王便开始大吼大叫，表示要对苏格兰宣战，要塞西尔去警告莫雷伯爵，若他与其他苏格兰贵族们继续囚禁玛丽·斯图亚特，或胆敢威胁她的生命与安危，伊丽莎白女王将以身为统治者之名，用最强烈的手段进行报复。当塞西尔试图为莫雷伯爵辩护时，伊丽莎白女王勃然大怒地表示，若有人能包容邻国统治者遭到非法手段推翻，显然对于自己国家的在位者也不抱着尽忠职守的心意。然而塞西尔不为所动，只提醒她若向苏格兰方面威胁宣战，对方可能会故意处决玛丽·斯图亚特。
一周后，英国国务大臣塞西尔十分确定女主公并不真想与邻国开战，阴郁地表示女王的所作所为，有损他过去七八年来好不容易与苏格兰建立的邦谊。尽管她不再表示要兴战，却仍不断谴责莫雷伯爵。塞西尔对她的想法了然于心，他知道女王并不希望让人们认为她对表亲玛丽·斯图亚特抱持着偏见，而且她也为自己担心，害怕臣子胆大妄为以苏格兰事件为师来反抗她。到了八月二十二日，当莫雷伯爵被选为摄政议会议长时，伊丽莎白女王拒绝承认他的正当地位，也不愿承认詹姆士六世为新任苏格兰王。一直到十月份她才冷静下来，直面苏格兰情势已无法挽回的事实。
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六月份，伊丽莎白女王派遣萨赛克斯伯爵前往维也纳的哈布斯堡王朝，将嘉德勋章的殊荣献给马克西米连二世，并一探查尔斯大公的真面目。他送回的报告十分有帮助：查尔斯大公身材修长，留着红棕色的头发与胡髭，“脸部比例均匀，和蔼可亲，肤色也非常健康；他的表情与言语都使人感到愉快，谦恭有礼却仍保有其应有的尊贵；身材比例好，没有畸形或瑕疵；双脚都很干净，比例极佳，有着能和身高匹配的粗细程度”。而且“整个人没有什么让人感到不悦之处”。他能流利地使用四种语言，德文则是他的母语，他在哈布斯堡王朝非常受人崇敬，据说非常聪颖、心胸宽阔又勇敢。深谙打猎之道、骑术、纵鹰猎捕与各种户外活动，萨赛克斯伯爵甚至大赞他的马术。他非常聪明，教育程度极高，而且非常富有，生活在“尊荣与尊贵之中”。
两国联姻协商成功唯一的绊脚石就是宗教问题了，就算是为了取悦伊丽莎白女王，查尔斯大公也不愿改信。只是哈布斯堡王朝君主已经准备让步：只要伊丽莎白女王的态度软化，让他弟弟除了公开陪伴她参加圣公会礼拜外，可以私下参与弥撒仪式，如此一来，查尔斯大公就绝不会做出任何破坏英国国教的事情，同时也愿意马上迎娶伊丽莎白女王。到了十月，萨赛克斯伯爵写信给伊丽莎白女王，呼吁她接受这个条件，同时私下寄给塞西尔一个纸条：“各界的看法是，若女王陛下在他的宗教争议上不愿满足他，那就代表她绝对不想接受这件事。”
因为此事的高度争议性，伊丽莎白女王转向枢密院寻求意见。塞西尔与诺福克公爵都倾向接受对方的妥协，但莱斯特伯爵认为女王成婚将毁了他的一切，而北安普敦侯爵、潘布鲁克伯爵与佛朗西斯·诺利斯爵士均反对。尽管知道不能再拖太久，必须给查尔斯大公一个答案，但伊丽莎白女王依然无法下定决心，几周来，枢密院中的反对派一直抗争，想让女王接受他们的观点。至于在维也纳方面，让萨赛克斯伯爵感到愤怒不已的，就是莱斯特伯爵用尽心机——“完全不讨人喜欢”——破坏联姻计划，包括策动积极派的新教神职人员强烈反对，不让信仰天主教的查尔斯大公接近圣坛。
最终莱斯特伯爵获得了胜利。十二月十四日这天，伊丽莎白女王亲自结束了长达八年的联姻协商，写信给萨赛克斯伯爵，表示让查尔斯大公私下进行他的宗教仪式，完全违背了她的道德观及宗教统一的政策。就算她个人答应了，英国国会也不一定会愿意，在没有国会的背书下，她绝不会一意孤行。塞西尔、诺福克公爵与萨赛克斯伯爵的希望也到此告终，而他们将令人失望的结果全都怪罪到莱斯特伯爵身上，同时也预见“伊丽莎白女王终身不婚可能带来的损害”。哈布斯堡王朝君主也感到“震惊不已”，同时拒绝伊丽莎白女王对查尔斯大公访英讨论宗教事宜的要求——她也已经料到他会拒绝——沮丧的萨赛克斯伯爵则交出嘉德勋章，展开了返家的长途旅程。